抗酸菌検査について

●抗酸菌検査について
１．塗抹検査 ：直接法、集菌法
２．培養検査 ：固形培地（小川培地）、液体培地（MGIT培地等）
３．遺伝子検査 ：PCR法、MTD法
４．菌種同定検査 ：
　キャピリアTB（イムノクロマトグラフィ法）
　アキュプローブ（DNAプローブ法）
　DDHマイコバクテリア（ハイブリダイゼーション法）
５．感受性検査
　普通法・小川比率法
　マイクロタイター（ビットスペクトルSR）法
　　　　　　　　　　　　　　　　／ウエルパック法
　ブロスミックMTB-1法
　MGIT抗酸菌システム
　ピラジナミダーゼ試験

１．塗抹検査
　開放性の場合の検体には、抗酸菌としてヒト型結核菌及び
　非病原性の非結核性抗酸菌が認められることがある。
　そのため、塗抹鏡検の結果で結核と断定することは慎重を要する。


２．培養検査
培地は大別して卵培地(小川培地またはLowenstein-Jense培地)、
寒天培地(Middlebrook 7H10または 7H11培地)、および液体培地がある。・固形培地（小川培地）
　M.tuberculosisおよびその他Mycobacterium spp.の選択分離培地で、
　発育阻害物質を含む寒天やペプトンを使用せず、全卵を用いて固める。
　喀痰を処理するNaOHの濃度に対応し、含まれるリン酸2水素カリウムの
　濃度によって3%及び1%組成がある。小川培地以外にも、ビット培地、
　Lowenstein-Jensen培地などがある。MGITなどの液体培地の発達により、
　不要かと言われればそういうわけでもない。液体培養で生育の悪い抗酸菌の
　検出、抗酸菌混合感染例の見落とし防止、液体培地雑菌汚染時のレスキュー、
　菌量の把握が出来る、安価であるなどメリットは多い。

・MGIT（Mycobacteria Growth Indicator Tube）法
　　　　　　　　　　（SeptiChek AFB，MGIT，BACTEC9000MB，MB/BacT）
　液体培地を使用し、酸素蛍光センサーを備えた抗酸菌検出システム。
　日本の10施設で行われた共同評価データから、以下のような評価結果がある。
　・喀痰などからの全抗酸菌の検出率は、小川法に比べ、4.1～11.6%高かった。
　・MGIT法は小川法に比べ、結核菌群では約20%、NTM群では
　　約30%高い検出率を示した。
　・塗抹陰性検体での菌検出能力では、MGIT法が小川法より優れていた。
　・MGIT法は小川法に比べ、結核菌群では5～12日、
　　NTM群では10～24日早く菌を検出した。


３．遺伝子検査
　接検体から菌の遺伝子を検出する核酸増幅法検査では、
　RNA増幅法によるAmplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test(MTD)、
　PCR 法によるAmplicor Mycobacterium、およびLCR法による
　LCXM.ツベルクローシス・ダイナジーンが日本で保険適応になっている。
　MTDとLCXはM.tuberculosis complexを、Amplicor Mycobacteriumは
　M.tuberculosis complexのほか、M.aviumとM.intracellulareも
　検出・同定できる。これらの遺伝子増幅検査の検出感度は約70％、
　特異度は96％以上である。PCR陰性でも、培養法のほうが感度が高いので
　後から結核菌培養陽性になることがある。また、死菌でもPCR陽性になるので
　培養法で陰性になることがある。


４．菌種同定検査
　当院では、キャピリアTBでTBかどうかを判断し、その後アキュプローブで
　MAC、M.kansasii、M.gordonaeの同定をおこない、　
　同定不能の場合DDH法を用いている。

・キャピリアTB（イムノクロマトグラフィ法）
　結核菌群が産生するMPB64（菌体外に分泌されるタンパク質）を
　タ－ゲットとして検査する。非結核性抗酸菌はこのMPB64を産生しないため、
　ヒト型結核菌と他の抗酸菌との鑑別に用いられる。液体培地用に開発された。
　特別の装置を必要とせず、操作が極めて簡単であり、習熟を必要としない。
　また迅速（15分）に結果が得られる。問題は、MGIT陽性になった検体でも
　結核菌の量が少ない（MPB64の産生量が少ない）場合ラインが出来ない点である。・アキュプローブ（DNAプローブ法）
　特異性に優れている。結核菌、MACの同定が行える。

・DDHマイコバクテリア（DNA-DNAハイブリダイゼーション法）
　結核菌、MAC、M. kansasii、M. abscessusを含めた18菌種の同定が行える。
　日常的に診療するNTMの大部分が同定可能である。
　小川培地に発育した菌コロニーの同定検査には、これが最適かもしれない。
　メリットとしては、以下が挙げられる。
　・1回の検査で18菌種の同定ができる。
　・培養菌1コロニーでも同定可能である。
　・1検体ごとの試薬キットなので、試薬消費が一番少ない


５．感受性検査
当院ではMGIT→小川比率法の流れになっている。

・普通法
　小川培地を用いた方法で、従来から広く行われてきた方法で結果の信頼性は
　高い。絶対濃度法と比率法がある。培地中の成分が薬剤感受性に影響を
　与えたり、長期の保存で培地中の抗菌薬の薬効が低下する場合がある。
　指針では小川培地を用いた比率法(proportion method)が採用されている。
　INH については試験濃度を2濃度設定しているが、通常の治療には
　0.2μg/mlを参考にし、1.0μg/mlはMDR例で使用可能な薬剤がない場合に
　参考とする。小川培地では薬剤とくにRFPが卵へ吸着し正確な試験濃度が
　得られないという欠点があるため、小川培地を用いた検査でRFP耐性で
　あった場合他の検査法で再検する必要がある。

・マイクロタイター（ビットスペクトルSR）法／ウエルパック法
　簡便だが、感受性のものを耐性と判定する場合がある。
　マイクロタイター・ビットスペクトルSRなどがある。
　検査法の問題点として、臨床検査室で使われる頻度の高い
　マイクロタイター法（ビットスペクトルSR法など）と液体培地法で、
　ときに検査結果に不一致が見られることがある。とくにEBやSMでビットで
　耐性と判定されることがある。これは、マイクロタイター法は
　培地量が少ないので、菌量が過剰であると、感受性でも菌が増殖して、
　耐性と判定されるためと考えられる。結核病床を持つ各施設で
　マイクロタイター法／ウエルパック法により耐性と判定した菌株を、
　結核研究所で普通法検査したところ、それ60％以上で感受性だった。

・ブロスミックMTB-1法
　微量液体稀釈法で、ＭＩＣ値が判定可能。
　培養期間が短く、普通法とよく相関する。

・MGIT抗酸菌システム
　培養期間が１週間と短く、普通法、米国臨床検査標準委員会の標準法
　（M24-T）とよく相関するが、INH、RFP、SM、EB４剤にしかできない。
　MGITによる薬剤感受性検査でHRES感受性の場合そのまま確定する。
　もしMGITでHRESのどれかに耐性があった場合、小川培地による
　比率法で再検査し、その結果を確定とする。
　MGIT耐性はINHとSMにおいては、一概に信頼しない方が良い。
　INH耐性でも小川比率法を待つ。

・ピラジナミダーゼ試験
　PZA耐性がピラジナミダーゼ活性と相関することを利用した方法。
　ピラジナミダーゼ活性があれば耐性と判定される。
"文責"倉原優